CRISPR–Cas13——一种2类VI型RNA核酸内切酶，具有两个用于RNA切割的高级真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)结构域——靶向并降解RNA。RNA靶向已广泛用于酵母、植物、果蝇、斑马鱼和哺乳动物中RNA的裂解。它也被用于检测核酸存在的分析。
现在，研究人员已经开发出一种快速灵敏的双荧光报告系统，可以检测附带效应。在这样做的过程中，他们发现Cas13可以在HEK293T细胞中诱导大量的附带效应。此外，他们使用该系统测试新设计的变体，揭示了显着减少脱靶效应的高保真Cas13(hfCas13)变体。
该研究发表在《自然生物技术》(NatureBiotechnology)上的论文“High-fidelityCas13variantsfortargetedRNAdegradationwithminimalcollateraleffects”中，证明了hfCas13在哺乳动物细胞和动物中几乎没有附带损伤的情况下高效靶向RNA降解的可行性。
人们对Cas13的脱靶效应表示担忧。先前的结构研究表明，当Cas13与靶RNA结合时，两个HEPN核酸酶结构域可能在蛋白质表面形成一个催化位点，从而产生除了靶RNA的靶向切割之外的旁观者RNA的混杂切割的可能性。
由于这种附带效应，Cas13可能会随机降解目标和非目标RNA，因此难以设计实验和解释结果。
在这项研究中，研究人员设计了一种双荧光报告基因(EGFP和mCherry)质粒系统来检测Cas13在哺乳动物细胞中的附带作用。在这个系统中，mCherry荧光细胞的丢失被解释为成功的靶向编辑;EGFP荧光细胞的丢失被解释为脱靶切割。在200多个工程变体中，几个Cas13变体(包括Cas13d和Cas13X)表现出高效的靶向活性，但显着降低了侧支活性。
然后，研究人员试图通过诱变来改造Cas13d(RfxCas13d，一种来自RuminococcusflavefaciensXPD3002的Cas13d)，并基于新的双荧光报告系统，该系统包含一个含有EGFP、mCherry和EGFP靶向的质粒，并筛选具有最小附带效应的变体gRNA，连同每个Cas13变体。
该团队设计并生成了一个Cas13d变体的诱变文库，并将它们分别转染到HEK293细胞中。通过使用流式细胞仪分析报告基因荧光，五个变体(N1V7、N2V7、N2V8、N3V7和N15V4)表现出相对较低百分比的EGFP+细胞，但表现出较高百分比的mCherry+细胞，表明靶向活性高但侧支活性降低。
变体N2V8是一种高保真Cas13d(hfCas13d)，由于其对RNA降解的高度特异性，被用于进一步表征，包括使用RNA测序的转录组范围的脱靶分析。hfCas13d在靶向多个内源转录本(如PPIA)时显示脱靶基因数量显着减少。此外，hfCas13变体未显示对细胞系、转基因动物和体细胞造成可检测到的附带损害，因此支持它们在体内的应用。
该团队在2021年确定了CRISPR-Cas13X系统，这是迄今为止已知的最小(仅775个氨基酸)RNA编辑工具。在他们的新研究中，由中国科学院神经科学研究所杨辉博士和HuiGeneTherapeutics的研发团队领导的研究人员进一步改造了Cas13X，并获得了hfCas13X变异体，该变异体表现出高靶向特异性。RNA降解但附带影响最小。hfCas13X在基于RNA编辑的基因治疗领域显示出巨大的应用潜力。在这项研究中发现的Cas13变体在未来的RNA编辑和治疗应用中可能更有用。